引物设计软件_使用oligo6和premier5.0软件设计pcr引物

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聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction。PCR)是20世纪后期发展起来的一种体外扩增特异DNA片断的技术。具有快速、简便及高度敏感等优点，能极大地缩短目的基因扩增时间。因此，其一直是生物学者们致力于构建cDNA文库、基因克隆以及表达调控研究的必要前提和基础。PCR的第一步就是引物设计。引物设计的好坏，直接影响了PCR的结果，因此这一步很关键。成功的PCR反应既要高效，又要特异性扩增产物，因此对引物设计提出了较高的要求。引物设计需要注意的地方很多，在大多数情况下，我们都是在知道已知模板序列时进行PCR扩增的。在某些情况比如构建文库的时候也会在不知道模板序列的情况下进行设计。这个时候随机核苷酸序列就与模板不是完全匹配。我们通常指的设计引物都是在已知模板序列的情况下进行。设计的目的是在两个目标间取得平衡：扩增特异性和扩增效率。

引物设计原则

设计引物需要考虑诸多因素，如引物长度(primer length)，产物长度(product length)，序列Tm值 (melting temperature)，ΔG值(internal stability)，引物二聚体及发夹结构(duplex formation and hairpin)，错误引发位点(false priming site)，引物及产物GC含量(composition)，简单总结出以下的要点：

1. 引物的长度一般为15-30bp，常用的是18-27bp，但不应大于38bp，因为过长会导致其延伸温度大于74℃不适于Taq DNA聚合酶进行反应。
2. 引物序列的GC含量一般为40%-60%，过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。
3. 引物3’端的序列要比5’端重要。引物3’端的碱基一般不用A，因为A在错误引发位点的引发效率相对比较高。另外引物间3’端的互补、二聚体或发夹结构也可能导致PCR反应失败。5’端序列对PCR影响不大，因此常用来引进修饰位点或标记物。
4. ΔG值(自由能)反映了引物与模板结合的强弱程度。一般情况下，引物的ΔG值最好呈正弦曲线形状，即5’端和中间ΔG值较高，而3’端ΔG值相对较低，且不要超过9(ΔG值为负值，这里取绝对值)，如此则有利于正确引发反应而可防止错误引发。
5. 引物所对应模板序列的Tm值最好在72℃左右。Tm值的计算有多种方法，如按公式Tm =4(G+C)+2(A+T)，在Oligo软件中使用的是最邻近法
6. 引物二聚体及发夹结构的能值过高(超过4.5kcal/mol)易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR反应不能正常进行。
7. 对引物的修饰一般是在5'端增加酶切位点，应根据下一步实验中要插入PCR产物的载体的相应序列而确定。

值得一提的是，各种模板的引物设计难度不一。有的模板本身条件较差，比如GC含量偏高或偏低，导致找不到各种指标都十分合适的引物；有时PCR产物要作为克隆对象插入到载体中表达，因此PCR引物设计的可选择度很低。遇到这种情况只能退而求其次，尽量去满足条